描述
AFDye 555 NHS ester
(Alexa Fluor 555 NHS ester Equivalent)
产品信息
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产品名称 |
产品编号 | 规格 | 价格（元） | 促销价（元） |
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AFDye 555 NHS ester (Alexa Fluor 555 NHS ester Equivalent) |
MX6022-1MG | 1mg | 1100 |
950 |
| AFDye 555 NHS ester (Alexa Fluor 555 NHS ester Equivalent) | MX6022-5MG | 5mg | 2300 |
1950 |
产品描述
AFDye 555是一种水溶性、强光稳定性的染料，具非常高的光量子产量。AFDye 555是一种发橙色荧光的染料，可使用488nm或532nm激光谱线进行激发。是Cy3或四甲基罗丹明的替代品，在活细胞和固定细胞中的光稳定性优于Cy3。在pH 4-10范围内耐受性强。
AFDye555 NHS ester (Equivalent toAlexa Fluor 555 NHS ester）是一种胺反应、发橙色荧光的染料，通常通过伯胺来标记蛋白或抗体、多肽、胺基修饰的寡核苷酸，以及其它含胺基生物分子。这一标记通常在pH 7-9范围最有效，形成稳定和共价酰胺键。
产品特性
| 同义名：AFDye 555 Succinimidyl Ester; AFDye 555琥珀酰亚胺酯； | 纯度：≥95% |
| 激光谱线：488nm或532nm | 外观：固体 |
| Ex/Em：555/565 nm | 溶解性：溶于水，DMF，DMSO |
| 摩尔吸光系数：150,000 cm-1M-1 | A280/Amax：8% |
| 光谱相似染料：Alexa Fluor® 555, DyLight® 550, Cy3 | 常用滤光片组：TRITC |
保存与运输方法
保存：-20ºC避光干燥保存，2年有效。
运输：冰袋运输。
注意事项
1） 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2） AFDye NHS ester系列染料虽有一定的水溶性，但，强烈推荐用DMSO、DMF溶解配制母液，再进行后续的标记实验。因为，在水溶性体系中这些反应性基团非常容易被水解生成非反应性的游离酸形式。
3） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、染色步骤（以免疫球蛋白IgG的标记为例）
几乎所有蛋白或多肽都能用胺反应试剂（探针）来标记。以下是针对IgG抗体而优化的标记步骤，用户可根据自身蛋白量来放大或缩小反应体系，但为了得到理想的染色结果，蛋白浓度不得小于2mg/ml。由于不同蛋白（多肽）所含胺基数目、胺基表面位置都有巨大差别，建议用户在初次实验时，建立三组不同的胺反应试剂：蛋白的摩尔比，以筛选出能达到最佳标记效率的摩尔比。
1.1 于1ml 0.1M碳酸氢钠缓冲液充分溶解~10mg蛋白。
注① ：蛋白浓度通常为5-20mg/ml，偶联的成功率对蛋白浓度具高度依赖性。当浓度低于2 mg/ml，会严重影响标记效率。
注② ：标记体系应避免任何含胺基底物，如Tris、glycine、铵盐、或其他稳定蛋白如BSA等，如待标记的蛋白溶液中含有上述物质的污染，则需透析到10-20 mM的磷酸盐缓冲液（PBS）中，再向每ml蛋白溶液中加入0.1 ml 1M碳酸氢盐缓冲液（pH 8.3–9.0）调至所需pH值。
注③ ：抗体溶液中存在的低浓度叠氮钠（＜3 mM）或硫汞撒（＜1 mM）不会干扰标记反应。
1.2 用高质量无水DMF或DMSO溶解胺反应试剂（探针）（比如：AFDye555 NHS ester）至10 mg/ml。
注①：AFDye 488 NHS ester的水溶液务必现配现用，不可保存，因其在水溶液中，会被水解成非活性游离酸。AFDye 488 NHS ester的DMSO储存液可置于≤-20℃保存，建议2周内用完。
1.3 一边搅拌或涡旋蛋白溶液，一边缓慢加入50-100 µl 胺反应试剂（探针）。
注①：加入胺反应试剂（探针）的量在0.5-1 mg，总的来说，约1/4-1/3的胺反应试剂会偶联到蛋白上。不同的蛋白和标记试剂的标记效果不同，请根据具体情况优化两者比例。
1.4于室温缓慢搅拌避光孵育1h（或更长）。
1.5【可选】通过加0.1ml新鲜配制的1.5M羟胺（pH 8.5）来终止反应，于室温孵育含羟胺体系1h。
1.6纯化：选择一种合适的方式（比如：透析法、P-30柱子或PD-10柱）来纯化标记产物，去除盐离子或未反应的胺反应试剂。
1.7贮存：标记好的蛋白避光保存于2-8℃。若纯化的蛋白偶联物浓度＜1mg/ml，加入BSA或其它稳定蛋白1-10mg/ml。在2mM叠氮钠存在的情况下，2-8℃可保存几个月。若需保存更长时间，需分装后于-20℃避光保存，避免反复冻融。
二、计算标记比例（F/P值）
对于免疫球蛋白IgG等大多数抗体来说，摩尔吸光系数为203000，F/P值在4～9之间是最合适。
2.1AFDye555标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和555nm的光吸收；
2）计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A555×0.08))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例：每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A555×稀释倍数/(150000×蛋白摩尔浓度)
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— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】