Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry
细胞表面抗原免疫荧光染色（流式分析）
产品标签：
Cell surface antigen 细胞表面抗原；RBC Lysis Buffer 红细胞裂解液；TruStain FcX™ Fc受体封闭剂；Flow cytometry（FC）流式分析；cell staining buffer 细胞染色缓冲液；
背景描述：
通过荧光标记抗体和流式细胞术检测，细胞表面标记（Cell surface marker）能够用来确定细胞亚群，基于来源，发育阶段和功能。这些表面标记呈现不同形式和功能，包括识别可溶性和细胞连接配体的受体，离子通道，糖蛋白，磷脂等。比如CD4是辅助性T细胞（Th细胞）的表面标记，基于其他趋化因子受体和白细胞分化抗原标记能进一步被分类鉴定。
细胞表面抗原免疫荧光染色-流式分析步骤：
此步骤做交流学习用，具体的实验方案因实验而异。
A．组织和细胞收集
1. 收集理想组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓）并制备悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）的单细胞悬液。如果使用体外刺激细胞，只需将刺激活化的细胞简单悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）。
2. 加细胞染色缓冲液（cell staining buffer）高达~15ml，然后350xg离心5min，吸掉上清。
B．红细胞裂解
3. 用3ml红细胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重悬细胞或根据具体情况加入相应量的红细胞裂解液。冰上孵育5min。
4. 加10ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）到管内终止细胞裂解，然后350xg离心5min，吸掉上清。
5. 如步骤2重复一次清洗。
6. 细胞计数，用细胞染色缓冲液冲重悬细胞使浓度为5-10 x 106cells/ml，按照100µl/管分装细胞悬液到12 x 75mm塑料管中（5-10 x 105cells/ml）。
C．Fc受体封闭
7. 阻断Fc受体的试剂适用于降低非特异性免疫荧光染色。小鼠样本，使用特异性结合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体可用于封闭抗体的非特异性染色。此种情况下，100 µl染色体积按照每106个细胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体，混匀，冰上孵育5-10min。
8. 人样本，每100 µl染色体积加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受体封闭剂)，混匀，室温孵育5-10min。在不含有有效/可得的封闭抗体情况下，使用过量的相同物种来源的纯化IgG和免疫荧光染色用抗体相同来源的IgG亚型作为替代方法来封闭细胞。
D．抗体的细胞表面染色
9. 按照预先优化的浓度，加入合适的荧光素、生物素偶联抗体或纯化的一抗（如：anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上避光孵育15-20min。
10. 至少使用2ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）清洗细胞，350xg离心5min，吸掉上清。重复一次。
11. 如果使用纯化的一抗，需在残留的缓冲液中重悬细胞，加入预先优化浓度的荧光二抗，冰上避光孵育15-20min。
12. 重复步骤10。
13. 用0.5ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）重悬细胞，每106个细胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（7-AAD Viability Staining Solution）对死细胞染色。
14. 避光冰上孵育3-5min。
15. 用流式细胞仪分析结果。
【注意】：如果不能立即使用流式细胞仪分析样品，避光保存样品，并且置于4-8℃保存。样品必须重悬于细胞染色液中。注意细胞样品不应该放在固定缓冲液更长时间，因其会影响荧光素构象和荧光信号。
实验用产品信息：
| 品牌 | 货号 | 名称 | 规格 | 价格（元） |
| MKbio | MX1501-100ML | Red Blood Cell Lysis Buffer 红细胞裂解液 | 100ml | 120 |
| MKbio | MX1504-500ML | Cell Staining Buffer 细胞染色缓冲液 | 500ml | 250 |
| MKbio | MX1505-50T | Fc Receptor Blocking Solution, Human | 50T | 1060 |
| Biolegend | 422301 | Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) | 50T | 1190 |
| Biolgend | 422302 | Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) | 200T | 2730 |
| MKbio | MX4216-150T | 7-AAD Viability Staining Solution 7-AAD细胞活力染色液 | 150T | 150 |
| BD Falcon | 352063 | 5ml圆底试管（流式管）12X75MM聚丙烯锁扣帽 | 25个/包 | 56 |
| BD Falcon | 352063 | 5ml圆底试管（流式管）12X75MM聚丙烯锁扣帽 | 500个/箱 | 732 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持”品质保障”的原则为广大客户提供优质产品。