Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒

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Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒

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Reactive Oxygen Species,ROS活性氧;DCFH-DA;JC-1线粒体模电位探针;JC-10;CAS NO:4091-99-0;

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  Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒   MX4801-1KIT   100~500T   468

研究意义:

活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

产品描述:

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit,或ROS Assay Kit)是一种利用荧光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)进行细胞内活性氧水平检测的常用方法。检测原理在于DCFH-DA本身无荧光,能自由穿过细胞膜,一旦进入细胞后,被胞内的酯酶水解生成无荧光的DCFH。DCFH不能穿透细胞膜,从而保留在胞内。此时胞内的活性氧可以氧化DCFH生成有荧光的DCF。通过DCF荧光的强弱即可反映活性氧的水平。

本试剂盒包含活性氧阳性对照Rosup,利于活性氧的检测。Rosup是一种混合物,浓度为50mg/ml。因检测对象和反应体系的不同,本试剂盒可检测100-500个样品。

产品组成:

 组分编号         组分名称                                              规格               储存方法
 MX4801-A  活性氧探针DCFH-DA(10mM)  0.1ml  -20℃避光保存
 MX4801-B  活性氧阳性对照(Rosup, 50mg/ml)  1ml  -20℃保存
— —  产品说明书

1份

保存与运输方法:

保存:-20ºC保存,有效期一年。

运输:冰袋运输。

使用方法

1. 装载探针

【注意】:对于刺激时间较短(通常2h以内)的细胞,先装载探针,后用活性氧阳性对照Rosup和/或待研究药物刺激细胞;对于刺激时间较长(通常6h以上)的细胞,先用活性氧阳性对照Rosup或待研究药物刺激细胞,后装载探针。

1.1 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)

1)检测前一天进行细胞铺板,确保活性氧检测当天细胞汇合率达到50~70%。

2)吸出细胞培养液,加入适量体积以及浓度的待研究药物,于37ºC细胞培养箱内孵育,具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。

【可选】阳性对照Rosup:先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照,通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高,可以适当提高Rosup的工作浓度;反之,如果活性氧升高过快,则适当降低Rosup的工作浓度。

3)按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA(10mM),使其终浓度为10μM.。吸出细胞培养液,加入适当体积DCFH-DA工作液。【注意】:加入体积以能充分盖住细胞为宜。对于6孔板,每个孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。对于96孔板,每个孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4)37ºC细胞培养箱内孵育20min。

5)用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针

1)按照常规方法,清洗并收集足量的细胞。【注意】:保证细胞的状态健康。

2)用适量体积以及浓度的待研究药物重新悬浮细胞,于37ºC细胞培养箱内孵育,具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。【可选】阳性对照Rosup:先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照,通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高,可以适当提高Rosup的工作浓度;反之,如果活性氧升高过快,则适当降低Rosup的工作浓度。

3)探针装载前,按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA(10mM),使其终浓度为10μM.。

4)离心,吸出细胞内刺激药物,之后用适量DCFH-DA工作液重悬细胞,使得细胞密度为1×106~2×107/ml。【注意】:细胞密度需根据后续检测体系,检测方法,以及检测总量来调整。例如,对于流式分析,单管检测内细胞数目控制在104~ 106之间。

5)37ºC细胞培养箱内孵育20min。每隔3~5min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。

6)用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

2. 检测

2.1 原位装载法

可用激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2.2 收集细胞后装载法

可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可用激光共聚焦显微镜直接观察。

3. 参数设置

使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可用FITC的参数设置检测DCF。

4. 其他说明

1)对于某些细胞,若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1:2000~1:5000稀释DCFH-DA,使DCFH-DA的工作浓度为2~5μM。探针装载时间也可依情况在15~60min内适当进行调整。

2)Rosup仅仅用于作为阳性对照的样品,并不是在每个样品中都需加入Rosup阳性对照。

注意事项

1)探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。

2)探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。

3)尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。

4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 — — Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/MKBio懋康所有】

其他信息

重量 50 g
品牌:

懋康MKBio

CAS:

N/A

规格:

100~500T

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