Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒

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描述

Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒

产品关键词:

Calcein, AM 钙黄绿素AM;Calcein Red 钙黄绿素红;活细胞染色探针;Fluorescein diacetate (FDA);Propidium Iodide (PI) 碘化丙啶;CAS NO:148504-34-1;

产品信息

产品名称 产品编号 规格 价格(元)
Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒 MX3012-500T 500T 690
Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒 MX3012-1000T 1000T 1240

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【温馨提示】:见我司懋康生物(maokangbio)整理的钙黄绿素AM(Calcein AM)单个产品信息

产品描述

Calcein, AM,中文名钙黄绿素乙酰甲酯,CAS NO:148504-34-1,一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料,呈绿色荧光(Ex/Em= 490nm/515nm)。AM基团的存在不仅加强疏水性,使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分,本身不发荧光。一旦进入细胞后,被细胞内酯酶水解为钙黄绿素(calcein),能与胞内钙离子结合,产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性,从而被保留在胞内。与其它活细胞染料(如BCECF-AM,CFDA)相比,Calcein, AM最适合用于活细胞染色探针,因细胞毒性很低,而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。另外,使用Calcein, AM活性检测的实验结果十分可信,与标准的51Cr释放法所得结果一致。

由于死细胞缺乏酯酶,Calcein, AM仅对活细胞进行标记,这一特征使其非常适合用来检测细胞活力和细胞的短期示踪。常常与碘化丙啶PI联合使用,因其仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核,嵌入细胞的DNA双螺旋区域,并产生红色荧光(Ex/Em= 535nm/617nm),仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发,仅可观察到死细胞。结合这些特点,Calcein, AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。

本试剂盒就是结合Calcein-AM和PI的双重染料,来进行活细胞和死细胞的双重染色标记,从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据试剂盒优化体系,单次以200µl细胞悬液进行染色,分别可做500次(货号:MX3012-500T)和1000次(货号:MX3012-1000T)检测。

试剂盒组分

编号 组分 保存方法

产品编号/规格

MX3012-500T MX3012-1000T
MX3012-A Calcein AM Solution(4 mM) -20ºC避光 50μl 50μl×2
MX3012-B PI Solution(1.5 mM) -20ºC避光 200μl 200μl×2
MX3012-C 10×Assay Buffer -20ºC~4℃ 50ml 100ml

保存与运输方法

保存:-20℃避光保存,有效期一年。

运输:冰袋运输。

注意事项

1)由于Calcein-AM对湿度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。

2)碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,操作时一定要注意防护。若接触到皮肤,需要立即用自来水清洗。

3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、试剂准备

1.1 1×反应缓冲液(Assay Buffer)的配制

从低温冰箱内取出10×Assay Buffer,根据单次用量无菌条件取出适量,用去离子水(dH2O)做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

1.2 1×染色工作液(Stain Buffer)的配制

1) 先将低温保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液(1.5 mM)室温回温至少20min,使其充分融化。【注意:第一次使用时建议对储存液根据单次用量分装,特别是Calcein AM,以减少反复冻融次数。】

2) 取5µl Calcein AM溶液 (4 mM)和15µl PI溶液(1.5 mM)加入5ml 1×Assay Buffer,充分混匀。此时得到Calcein AM的工作液浓度为4μM,PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。【注意:染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。】

二、染色步骤

2.1 对于贴壁细胞,先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞,之后离心收集细胞(1000 rpm,3min)。

对于悬浮细胞,直接离心(1000 rpm,3min)收集细胞。

2.2 去上清,用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次,以充分去除残留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer制备细胞悬液,使其密度为1×105~1×106细胞/ml。

2.4 取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内,混匀,37℃孵育15min。

【注意:如果需要,可延长孵育时间至30min。】

2.5 荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外,使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

【注意】:可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min,或者用70%乙醇孵育细胞30min,从而制备死细胞;

b) 用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色,以得到仅仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

c) 用0.1-10µM的Calcein AM进行死细胞染色,以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色,去观察是否活细胞能被染色。

测定方法与结果呈现

1) 荧光显微镜(Fluorescent Microscopy)

检测方法:490±10 nm激发能同时看到呈黄-绿色荧光的活细胞和红色的死细胞。另,545nm激发可能只能看到呈红色的死细胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2) 荧光酶标仪(Fluorescent Plate Reader)

检测方法:96孔透明底的黑色酶标板(96-well black plate with clear bottom),Calcein检测的激发波长为490nm,发射波长为520nm;PI检测的激发波长为530nm,发射波长为617nm;

3) 流式细胞仪(Flow cytometer)

检测方法:流式细胞仪,Calcein检测的激发/发射波长为488/535nm,PI的激发和发射波长为488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常见问题

1、 该试剂盒适用任何细胞类型?

基本上适用于任何含酯酶活性的动物细胞。植物和细菌细胞因含有细胞壁,Calcein-AM不能进入因此无法染色。有可能对原生质体进行染色。

2、 用相同浓度有可能对所有哺乳动物细胞进行染色?

对所有细胞都用相同的浓度是很不合理的。Calcein-AM和PI的最佳工作浓度根据细胞类型差异很大。有必要根据具体细胞来确定最佳染料浓度。参考说明书染料工作浓度优化方法。

3、 Calcein-AM对细胞有毒?

与其他相似的活细胞染料比较,Calcein-AM基本无毒(毒性最小)。见文献EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

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货号 名称 规格
MX3011-50UG Calcein, AM, Ultra Pure Grade 钙黄绿素(绿色) 50μg
MX3012-500T Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒 500T
MX3013-1MG Calcein Red, AM 钙黄绿素红(红色) 1mg
MX3014-1MG Calcein Deep Red Acetate 钙黄绿素深红醋酸盐 1mg
MZ8471-1G Probenecid 丙磺舒 1g
MZ8472-154MG Probenecid Sodium, Water Soluble 丙磺舒钠(水溶性) 2×77mg
MX4205-10MG Propidium Iodide 碘化丙啶 10mg

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/MKBio懋康所有】

 

其他信息

重量 50 g
品牌:

懋康MKBio

CAS:

148504-34-1

规格:

500T

货期:

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