Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测试剂盒

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描述

Annexin V- FITC/PI Apoptosis Detection Kit

细胞凋亡检测试剂盒

产品信息

产品名称 产品编号 规格 价格(元)
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

细胞凋亡检测试剂盒

MX3210-20T 20T 650
MX3210-50T 50T 1350
MX3210-100T 100T 1980

产品描述

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit)是一款用来检测细胞凋亡的试剂盒,可以用流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。本试剂盒包含FITC标记的Annexin V,用来检测早期细胞凋亡;以及碘化丙啶(PI),用来检测坏死细胞。

本试剂盒的工作原理在于:磷脂酰丝氨酸(Phosphotidylserine,PS)是一种带负电荷的磷脂。正常细胞中,PS位于细胞膜内面,但当凋亡开始后,PS在磷脂双分子层中的不对称分布逐渐消失并转移到细胞膜表面,从而暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V(Annexin V)是一种分子量约35kDa的钙离子依赖性磷脂结合蛋白,能非常容易的结合PS,且具有高度的亲和性。因此,通过Annexin V与PS的结合与否来判断凋亡发生。另外,PI的引入能辅助区分凋亡早期细胞和晚期凋亡或坏死细胞。PI作为一种活细胞排斥探针,不能穿透具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡早期细胞,但能穿透丧失细胞膜完整性的凋亡晚期细胞或坏死细胞,从而将细胞核染红。因此,将Annexin V-FITC与PI联合使用时,呈现结果为:正常细胞(Annexin V-FITC-/PI-),早期凋亡细胞(Annexin V-FITC+/PI-);晚期凋亡细胞和坏死细胞同时呈现双阳性(Annexin V-FITC+/PI+)。

产品组成

组分编号 组分名称 保存方法 产品编号(规格)
MX3210-20T MX3210-50T MX3210-100T
MX3210-A Annexin V-FITC 2-8℃避光 100μl 250μl 500μl
MX3210-B 碘化丙啶溶液 2-8℃避光 200μl 500μl 1ml
MX3210-C 结合缓冲液(4×) 2-8℃ 4ml 10ml 20ml

保存与运输方法

保存:2-8℃保存,不可冰冻。其中组分A,B需避光保存。1年有效。

运输:冰袋运输。

注意事项

1) 由于细胞凋亡是一个快速过程,染色后请尽快检测,时间过长会导致凋亡或坏死细胞数量增加。

2) 对于贴壁细胞,需要很好掌控消化步骤。细胞凋亡诱导时贴壁细胞如有漂浮细胞,需同时收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色。处理贴壁细胞时要小心,尽量避免人为造成的细胞损伤。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,导致PI摄入过多;而胰酶消化时间过长,细胞膜也易造成损伤,甚至会影响细胞膜PS与Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇使胰酶与细胞充分接触,之后倒掉大部分胰酶,利用残留的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

3) 实验中若需固定细胞,比如凋亡检测同时还需要检测细胞周期,建议选用Annexin V-FITC,不要使用Annexin V-EGFP,因固定过程中EGFP会变性导致无荧光。

4) 若样品来源于血液,务必先去除血液中的血小板。因为血小板含有PS,会与Annexin V结合产生假阳性。可使用含EDTA的缓冲液并低速离心去除血小板。

5) 荧光物质易发生淬灭,试剂储存和操作过程中尽量避光。荧光检测时也尽量缩短观察时间。

6) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步骤

1.1 细胞样品的准备:

a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。 用不含EDTA的胰酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果无法完全离心至管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞:1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞,如果无法完全离心至管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。

1.2 用去离子水按照1:3稀释结合缓冲液到1×,比如,5ml结合缓冲液(4×)加入15ml去离子水。

1.3 用结合缓冲液(1×)重新悬浮细胞并调整浓度为1-5×106/ml。

1.4 取100µl的细胞悬液到5ml流式管中,加入5µl Annexin V-FITC混匀,室温避光孵育5min。

1.5 再加入10µl碘化丙啶溶液,并加400µl结合缓冲液(1×),混匀,尽快(<1h)用流式细胞仪或荧光显微镜完成检测。

【注意】:方便起见,步骤1.4内可同时加入5µl Annexin V-FITC和10µl碘化丙啶溶液混匀,室温避光孵育5min。然后加入400µl结合缓冲液(1×)混匀,但需尽快(<1h)用流式细胞仪或荧光显微镜完成检测。但为了减少实验误差,建议按照1.4-1.5的步骤来操作。因PI受时间影响比较大,细胞标记上PI后毒性会增加。随着时间延长会导致PI染色增加,尤其是检测早期凋亡时,误差会明显加大。建议PI加入后立即开始检测。

二、 染色检测

2.1流式细胞仪分析

1)请根据以下设计实验:

空白管:阴性对照组细胞,不加Annexin V-FITC和碘化丙啶溶液。目的用来调节电压。

单染管:阳性对照组细胞,只加Annexin V-FITC。目的用来调节补偿。

检测管:处理细胞组,加Annexin V-FITC和碘化丙啶溶液。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需的流式数据。

2)对于Annexin V-FITC(Ex=488nm,Em=525nm),用流式细胞仪的FITC信号检测器(通常F1通道);对于PI-DNA复合物(Ex=535nm,Em=615nm),用流式细胞仪的PE发射信号检测器(通常F2通道)。

3)用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),FITC为横坐标,PI为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型实验结果中,细胞可分成三个亚群,活细胞仅有很低强度的背景荧光,凋亡早期细胞仅有较强的绿色荧光,凋亡晚期细胞或坏死细胞有绿色和红色的双重荧光染色。

2.2荧光显微镜分析

1)滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。【注意】:对于贴壁细胞,可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。探针孵育结束后,可将盖玻片倒置在载玻片上并进行观察。需要在染色结束后尽快(<1h)进行观察。

2)于荧光显微镜下用双色滤光片(FITC/罗丹明)进行观察。早期凋亡细胞,仅结合Annexin V-FITC的细胞质膜呈现绿色。而丧失膜完整的细胞在细胞核上被PI染色呈现红色,且在细胞表面(质膜)上因被Annexin V-FITC染色呈绿色光环。

常见问题

1) Annexin V/PI凋亡试剂盒能够用于检测人或其他动物的细胞凋亡情况?

回复:可以,因Annexin V特异性结合PS,而PS在不同种属间无差异。

2)贴壁细胞做凋亡用胰酶消化对细胞膜有损伤?

回复:低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞2~3次,4℃,1000rpm离心5min, 处理得当的话, 胰酶造成损伤可以控制在 5%以内,在有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

3)贴壁细胞可先染PI然后再消化吗?这样是否可减少由于消化液造成的细胞膜损伤而染上PI的误差?

回复:先加 PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断, 而且PI本身对细胞也是有毒性的, 对实验结果影响会比胰酶大,不建议这样做。

4)为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞,用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响?

回复:因Annexin V是钙离子依赖性的磷脂结合蛋白,EDTA是一种金属螯合剂。因此EDTA的加入会影响Annexin V活性,进而影响结果。

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— —Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/MKBio懋康所有】

 

其他信息

重量 50 g
品牌:

懋康MKBio

CAS:

N/A

规格:

20T

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