活性氧ROS探针专题:APF 氨基苯基荧光素/HPF 羟苯基荧光素

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  • 2019年9月1日
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Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素

Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素

 

专题关键词:

Aminophenyl fluorescein (APF);Hydroxyphenyl fluorescein (HPF);Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物质;DCFH-DA;CAS:359010-69-8;

 

基本描述:

氨基苯基荧光素(APF)和羟苯基荧光素(HPF)是由T. Nagano开发的两种活性氧(Reactive oxygen species, ROS)指示剂,比H2DCFDA(DCFH-DA, DCFH)具更优秀的特异性和稳定性。APF和HPF显示有限的非选择性反应,和相对较高的光诱导氧化抗性。APF和HPF具细胞膜渗透性,本身无荧光,直到与羟基自由基或过氧亚硝基阴离子反应,还能与次氯酸阴离子反应,产生强绿色荧光(Ex/Em,~490/515nm),可用荧光显微镜、高通量成像仪、荧光酶标板或流式细胞仪检测。

 

工作原理:

中性溶液中氨基苯基荧光素(APF)和羟苯基荧光素(HPF)几乎是无荧光,当与高活性氧物质(highly reactive oxygen species, hROS)反应,能够生成具有高荧光强度的荧光素(Ex/Em, 490/515nm),且能观察到荧光强度的增加【见下反应原理图】。

 

探针特征:

□  APF,HPF选择性检测hROS比如羟基自由基(HO•)和过氧亚硝基阴离子(ONOO–),但不会与其他活性氧物质反应(•O2–,1O2, H2O2, NO等);

□  通过加入辣根过氧化物酶(HRP)能定量测定过氧化氢H2O2;

□  结合使用HPF和APF能特异性检测次氯酸(OCl-);

□  HPF和APF本身根本不会自氧化,从而与其他试剂相比能得到更可靠的数据;

□  能对活细胞进行成像检测;

 

ROS探针检测特异性比较:

□  试剂配制:1mg HPF/APF分别溶于DMF配制成5mM储存液。使用前用磷酸盐溶液(0.1M, pH 7.4)稀释500~5000倍(10~1μM)。将稀释液加入样本并孵育,然后测定荧光值(Ex/Em, 490/515nm)。

□  磷酸盐缓冲液体系(0.1M, pH 7.4),每一种荧光试剂(终浓度:10μM,0.1% DMF用作共溶剂)与各种活性氧物质反应。

□  HPF(Ex/Em=490/515nm), APF(Ex/Em=490/515nm), DCFH(Ex/Em=500/520nm)的荧光强度测定。

表1. 活性氧探针(HPF, APF, DCFH)对各种活性氧物质的反应特异性

ROS ROS产生方法  HPF (MX4805)  APF (MX4804) DCFH (MX4802)
HO• 100 µM高氯酸亚铁(II)+1 mMH2O2  730  1200 7400
ONOO– 3 µM (终浓度) ONOO–  120  560 6600
OCl- 3 µM (终浓度) OCl-  6  3600 86
1O2 100 µM 3-(1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl)propionic acid  5  9 26
•O2– 100 µM KO2  8  6 67
H2O2 100 µM of H2O2  2  <1 190
NO 100 µM NOC-7  6  <1 150
ROO• 100 µM AAPH  17  2 710
Autoxidation 荧光光照2.5h  <1  <1 2000

 

                        

 

ROS探针应用示例:

示例1:细胞经光诱导的自氧化检测(Light-induced autoxidation in cells)

1.1    探针加量:37℃避光孵育细胞30min,HPF或DCFH-DA(10μM each)

1.2    荧光测定:共聚焦显微镜观察荧光(激发波长488nm,检测波长>515nm);488nm波长辐射刺激细胞10s,然后再测定荧光。

1.3    实验图片:

 

示例2:猪中性粒细胞的体内成像(Bioimaging of porcine neutrophils)

2.1 猪中性粒细胞的纯化

a)从猪血中纯化中性粒细胞;b)将纯化的中性粒细胞溶于KRPD缓冲液(Krebs-Ringer phosphate buffer)(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4),置于冰上直至使用。将其转移到培养皿内。

2.2 探针加载与PMA刺激

a)加10μM HPF或APF到细胞,室温孵育30min。b)加入佛波酯PMA(2ng/ml)刺激中性粒细胞;

2.3 中性粒细胞的体内成像

刺激前或刺激后10min用共聚焦显微镜观察中性粒细胞(激发波长488nm,观察波长505nm-550nm)。

图. 中性粒细胞次氯酸阴离子(OCl-)检测。同时加载两个样品,一个用HPF检测,另一个用APF检测。OCl-的生成通过APF检测能看到荧光增强,通过HPF检测几乎看不到荧光变化。

产品信息:高品质产品,现货供应,欢迎来电咨询,021-54736159,QQ:2971634497。

 货号 名称 规格 价格(元)
 MX4804-1MG Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素 1mg 2080
 MX4805-1MG Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素 1mg 2080
 MX4802-50MG H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧(ROS)荧光探针 50mg 546

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 货号 名称 规格 价格(元)
 MX4801-1KIT  Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit

 活性氧(ROS)检测试剂盒

100~500T 328
 MZ2401-100UL  PMA (TPA, 5mg/ml)佛波肉荳蔻醋酸(5mg/ml) 100μl 280
 MS5603-50ML  tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP)

 叔丁基过氧化氢溶液

50ml 98
 MP5429-10MG  N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)

 N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸

10mg 588
 M36008(Invitrogen)  MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator   50 µg 650

 

注意事项

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/MKBio懋康所有】